前 言
《中华民族健康与疾病遗传资源共享平台生物标本的采集、处理、保存技术规程》在原有教育部资源共享平台建立的标准规范或制度的基础上，根据中华民族健康与疾病遗传资源实物样本的种类等特点，从样本的采集、处理、转运、保存等实物资源收集和保藏的各个环节进行了系统而详细的描述，形成一套完整的中华民族健康与疾病遗传资源收集与保藏规范，使遗传资源的收录和保护有所依照。

1.标本采集
1.1标本的种类与采集方法
中华民族健康与疾病遗传资源共享平台收集和保藏的标本涉及外周血、疾病组织、尿液、粪便、咽拭子等。
1.1.1外周血标本的采集（一切均应在无菌条件下完成）
采血前核对病人姓名、性别、年龄、编号及检验项目等，按试验项目要求，准备好相应的容器，如空白试管、抗凝管或促凝管等。病人应取坐位或卧位，采血部位通常是前臂肘窝的正中静脉。若用普通采血法，采血后应取下针头，将血液沿管壁缓慢注入试管内。
1.1.2疾病组织标本的采集
首先进行大体标本的观察或拍照，确认疾病组织的部位、范围，注意与周围组织及坏死组织的鉴别，在标本离体后应在最短的时间内切取标本(<30min)，将患病组织及其旁组织切取成多块直径为0.5 cm左右的组织块，分别装入已编号的灭菌冻存管中，迅速放入液氮转移罐并做好长期保存准备。
1.1.3尿液标本的采集
采集尿标本必须防止杂菌污染，严格无菌操作，一般多采集中段尿。收集的标本以晨起第一次尿液为佳，采集后立即送往生物资源库，（泌尿系感染大多病原菌，于室温放置时间较久，即可增殖）。
1.1.3.1中段尿采集方法
（1）女性采样前应先用肥皂水清洗，再用0．1 ％高锰酸钾水溶液冲洗尿道口，然后排尿弃去前段尿，留取中段尿10 ml 左右于无菌容器内，立即送往生物资源库。
（2）男性须将包皮翻开冲洗，然后采集中段尿。
（3） 儿童多数情况下仅冲洗外阴是不够的，故采集标本较为困难，如尿内细菌明显增多，可高度怀疑尿路感染。
1.1.3.1 肾盂尿采集法
为确定菌尿是否来自肾脏，可用导尿管采集肾盂尿，充分冲洗膀胱，以最后一次冲洗尿作为对照，而后用导尿管插入输尿管，分别标记左右两侧收集3 次尿，如输尿管菌数比对照尿菌数多或第3 次比第1 次多，该菌尿可能来自肾脏；反之，第1 次尿菌数多于第3 次尿菌数，则可能来自膀胱。该方法一般请泌尿科医师协助进行。
1.1.3.2 膀胱穿刺采集法
采集中段尿完全避免污染是很困难的培养结果与病情不符时，可采用耻骨上膀胱穿
刺采集尿液。此法用于厌氧菌培养或留尿困难婴幼儿。
1.1.3.3 导尿法
采取导尿管留尿是一种较好的无菌采集方法，取10 ～15 ml 于灭菌容器内送往生物资源库。
1.1.4 粪便标本的采集
1）选取有脓血、粘液部分的粪便2 ～3g ，液体粪便则取絮状物，装于灭菌盒中送往生物资源库。
2）在无法获得粪便的情况下，可用直肠拭子插入肛门4 ～5cm 处，取直肠表面的粘液，装于无菌试管或保存液中送往生物资源库。
1.1.5 咽拭子标本的采集
备齐用物，贴好标签，向病人说明目的以取得合作。点燃酒精灯，将拭子取出蘸无菌生理盐水（必要时以压舌板轻压舌部），嘱病人发“啊”音，以轻快的动作，迅速擦拭两侧腭弓及咽、扁桃体的分泌物后，速将试管口在酒精灯火焰上消毒，将拭子插入试管中塞紧，并立即送往生物资源库。

2 标本的标识
标本采到后应立即在标本采集管外贴上生物资源库条形码，及时送往生物资源库。

3 标本的处理
3.1提取DNA
3.1.1样品准备
3.1.1.1用血液提取DNA：
① 血液收集：血液必须用ACD(0.48% Citric Acid，1.32% Sodium Citrate，1.47% Glucose)抗凝。6ml血液用1ml ACD抗凝。因为从用肝素抗凝血液中抽提的DNA常有PCR抑制剂存在，不能用于PCR反应。血液4℃可以存放2周左右，-20℃可以放置1~2月。
② 由于红细胞和血小板不含细胞核，血液中的基因组DNA主要来源于白细胞和血液中的病毒等。通常从200µl血液中可获约2~4µg DNA。如果需要较大量的DNA，可以用500µl血液。处理方法如下：500µl血液中加入1ml无菌水，5,000转/分，离心2分钟去上清。用200µl TE将白细胞悬浮起来备用。
③ 新鲜血样品如不能立即用于抽提DNA，可置于4℃，但不要超过2个星期。欲长期储存，请分装成200µl/管，储存于-20℃。
3.1.1.2 从血清中提取DNA：
最好使用新鲜血清样品，否则样品应分装成200µl/管，-20℃保存。
3.1.1.3 从生物组织中提取DNA：
① 5~30mg组织样品用手术刀切成小块，在液氮中碾碎。
② 将粉末收集到1.5-ml离心管中，用200µl TE悬浮。
3.1.1.4 从尿液中提取DNA：
① 将尿液转移到离心管中，5,000 转/分，室温离心10分钟。
② 小心移走上清，沉淀用200μl TE悬浮。
3.1.1.5 从眼、鼻、喉等拭样(Swabs)中提取DNA：
① 将拭样(Swabs)转移到离心管中，加入2ml PBS(或生理盐水，用户自备)，室温浸泡2~5小时。
②　5,000转/分，室温离心10分钟。
③　小心移走上清，沉淀用200μl TE悬浮。
3.1.1.6 注意事项：
○1 如果样品的体积不足200μl，加入TE补足到200μl。
②　如果样品不能马上用于抽提基因组DNA，可于-20℃保存备用。
③　样品不能反复冻融，否则基因组DNA的完整性（长度）和产率都会受到影响。
④　样品不要太多，否则基因组DNA的纯度和产率反而下降。
3.1.2操作步骤:
3.1.2.1 在按样品准备方法制备的200μl样品中，加入400μl DCL Buffer，混匀; 加入3μl Proteinase K，混匀，55℃保温5~10分钟。
注意：① 应按次序加入，不得将Proteinase K先混入DCL Buffer，再加到样品中。② 保温时间取决于样品的类型。对于细胞样品，55℃保温5分钟足以使细胞裂解，释放出基因组DNA。而对于组织类样品，55℃保温则视降解效果而定。降解完全的样品应是透明不粘稠的液体。组织类样品一般在1-3小时内作用完全。过夜处理通常不影响产率。
3.1.2.2 加入260μl 无水乙醇，混匀，然后用1-ml Tip头将样品全部转移到UNIQ-10柱，柱子放入2.0-ml Collection Tube。
3.1.2.3 用台式离心机，10,000转/分，室温离心1分钟。
3.1.2.4 取下UNIQ-10柱，弃去Collection Tube中的废液。将柱子放回同一根Collection Tube中，加入500μl Wash Solution，10,000转/分，室温离心1分钟。
3.1.2.5 重复步骤4一次。
3.1.2.6 取下UNIQ-10柱，弃去Collection Tube中的全部废液。将柱子放回同一根Collection Tube中，10,000转/分，室温离心1分钟，以除去残留的Wash Solution。
3.1.2.7 将柱子放入新的无菌的1.5 ml离心管中，在柱子中央加入50μl Elution Buffer，室温放置２分钟。
3.1.2.8 采取10,000转/分，室温离心1分钟。离心管中的液体即为基因组DNA。根据用途，样品可于4℃或-20℃保存。
注意：① 为提高洗脱效率，可以将柱子在37-55℃保温２分钟。② 如果样品中基因组DNA含量很低，用30μl Elution Buffer洗脱可以提高洗脱液的样品浓度。但是，产率有所下降。③ 重复步骤7-8，可以提高产率20%。
3.1.2.9 用分光光度计按1OD260=50µg测量基因组DNA含量，并通过0.7%琼脂糖电泳凝胶判定DNA的完整性，也可以判定样品中是否有RNA。该试剂盒抽提出来的DNA长度可在50kb以上。
注意：① 血液样品中的DNA产量取决于血细胞的数量。② 从琼脂糖凝胶仅能观察到白细胞基因组DNA，血清中病毒DNA因含量太少，不能用琼脂糖凝胶直接观察。③ 通常50μl PCR反应体系中用1-5μl DNA抽提液。
3.2 提取RNA
3.2.1 从组织中提取总RNA、
1）液氮研磨：组织块直接放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨，待组织变软，再加少量液氮，再研磨，如此三次，按照每50~100mg组织加入1ml Trizol，转入离心管进行下步操作。
2）匀浆：用电动匀浆器充分匀浆1~2min。注意，组织样品体积不能超过Trizol体积的10%，否则匀浆效果会不好。
3.2.2 操作步骤：
○1 匀浆组织加入Trizol后，室温放置5min，使其充分裂解。注意：此时可以放入-70℃长期保存。
○2 室温，12000 r/min，离心5 min。取上清于一新管。
○3 按照1ml Trizol加入200µl氯仿，用手振荡混匀后室温放置2~3 min。
注意：禁用漩涡振荡器，以免基因组DNA断裂。
○4 4℃，12000 r/min，离心15 min。小心吸取上层水相于一新管。注意：千万不要吸取中间界面；若同时提取DNA和蛋白质，则保留下层酚相存于4℃冰箱中，如只提取RNA，则弃下层酚相。
○5 按照1ml Trizol加入异丙醇0.5 ml，混匀，室温放置5~10 min。
○6 4℃，12000 r/min，离心15min。弃上清，RNA沉淀管底。注意：RNA沉淀在离心之前是不可见的，常常在离心管的边缘或者底部形成凝胶状小球。
○7 按照1ml Trizol加入1ml 75%乙醇，震荡离心管，悬浮、洗涤沉淀。
○8 4℃，8000 r/min，离心5 min。尽量去除上清。
○9 室温晾干，或者真空干燥5~10 min。注意：RNA沉淀不要过于干燥，否则将会降低它的溶解度。
○10 用50µl ddH2O，TE Buffer（pH7.5），或者0.5% SDS溶解RNA沉淀，然后于55~60℃温育5~10 min。注意：ddH2O，TE Buffer（pH7.5），或者0.5% SDS 均必须用DEPC处理并高压灭菌；另外，如果RNA后面要用于限制性内切酶分析，则不能用0.5% SDS 溶解。
3.2.3 RNA质量检测
1）完整性：琼脂糖凝胶电泳分析RNA的完整性。Trizol试剂可以很容易地分离所有种类的RNA。例如利用Trizol分离老鼠肝脏总RNA，琼脂糖凝胶电泳结果显示，在7~15kb处，高分子RNA（mRNA和 hnRNA）呈不连续的带状分布，在5kb（28S）和2kb（18S）有两条主要条带，而在0.2kb处则是小分子RNA（tRNA和5S）。
2）纯度分析：计算A260/A280的比率。利用Trizol试剂提取的RNA，其A260/A280比率为1.6~1.8，如果用TE溶解，则A260/A280大于1.8。
3）浓度和产量分析：测OD值，定量RNA浓度，计算产量。
3.3 分离白细胞
3.3.1 外周血分离白细胞
1）取3ml正常人的外周血（枸橼酸钠抗凝）与等体积PBS混匀后小心的加于6ml白细胞分离液（33.9%泛影葡胺和9%Ficoll液按1：2.4体积比混合）液面上，1500r/min离心20 min。（或先将抗凝血离心，然后吸取中间白细胞层，再混以等体积PBS然后小心加于等体积细胞分离液液面上，离心同上）
2）吸取中间云雾状白细胞，加3－4mlPBS后3000 r/min离心10 min。
3）弃上清，加1ml PBS洗涤沉淀后，将细胞悬液转移至1.5mLEp管中。
4）3000r/min离心20 min，弃上清。
3.3.2 骨髓分离白细胞
1） 取3ml正常人的骨髓（枸橼酸钠抗凝，加的量为外周血的9倍）与等体积PBS混匀后小心的加于6ml白细胞分离液（33.9%泛影葡胺和9%Ficoll液按1：2.4体积比混合）液面上，1500r/min离心20 min。（或先将抗凝血离心，然后吸取中间白细胞层，再混以等体积PBS然后小心加于等体积细胞分离液液面上，离心同上）
2） 吸取中间云雾状白细胞，加3－4mlPBS后3000 r/min离心10 min。
3） 弃上清，加1ml PBS洗涤沉淀后，将细胞悬液转移至1.5mLEp管中。
4） 3000r/min离心20 min，弃上清。

4 标本的稳定化处理
①用于DNA扩增检测的标本，采集后一般不需要特殊的稳定化处理，但标本应及时送至生物资源库。
②由于RNA易受RNA酶的降解，因此用于RNA测定的标本有时必须进行稳定化处理，如流行病学调查的现场采样。异硫氰酸胍盐(Guanidine thiocyanate,GITC)可使DNA酶和RNA酶立即失活，因此在采集标本时，可将标本材料如血清或血浆按1:4的比例加至含有5mol/L GITC的试管中，从而使血清(浆)中的RNA酶不可逆失活。
③如果运输时间不能保证，也可将上述样本接种到培养基中送往生物资源库。

5 标本的贮存
临床体液标本如外周血等可于-70℃下长时间贮存。用于DNA测定的已纯化核酸样本可在10mmol/L Tris-1 mmol/L EDTA缓冲液(pH 7.5-8.0)中4℃保存。用于RNA测定的已纯化核酸样本应在缓冲液中-80℃或液氮中贮存。用乙醇沉淀的核酸样本贮存在-20℃即可。用GITC处理的RNA标本在室温可保存7天。

6 标本的运送、接收登记以及定位储存
(1)运送：为缩短标本在转运、入库过程中消耗的时间，保证标本的质量以及标本信息的完整，同时保证标本交接过程的准确无误，医护人员在采集标本或交接标本之前，应填写、发送电子版《生物资源库标本交接单》至资源库邮箱，并电话通知资源库工作人员准备接收标本。
资源库工作人员在接到标本采集者的通知后，按照《标本交接单》上面的信息准备相关的转运器材，打印《标本交接单》（2份），并在指定的时间到达指定地点接受标本。
资源库工作人员接收标本时，应仔细核对《标本交接单》上的各类信息，包括样本的种类、电子病历登记号、共享要求等信息，并与标本采集者互签纸质版的《标本交接单》，作为标本入库的正式凭据。
(2) 标本信息集成
资源库工作人员将样本的采样信息、保藏信息、临床和流行病学信息、共享信息、其他基本信息进行数字化表达并添加护照信息。
(3) 标本入库储存
装有标本的冻存管贴上标签后，通过扫描枪扫描标签上的储存信息，从而实现标本在资源库中的准确定位。